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摘要：目的 观察丹皮酚磺酸钠对兔子视网膜脱离模型中环氧合酶 -2 ( cyclooxygenase-2. COX-2 )的表达影响情况。 方法 将日本 大耳兔随机分为空白对照组、视网膜脱离模型组、视网膜脱离模型联合丹皮酚磺酸钠治疗组， 每组 3 只。各组分别于造模后的第 1 、3 、7 天各处死 1 只兔子，取眼球视网膜组织及玻璃体液，采用酶联免疫吸附测定( ELISA )检测其中 COX-2 的表达情况。结果 丹皮酚磺酸 钠治疗组与空白对照组、视网膜脱离模型组视网膜样本 COX-2 水平在第 3 天及第 7 天下降明显( P<0.05 ) 。结论 COX-2 在视网膜脱离 中具有重要作用 , 丹皮酚磺酸钠可通过下调其在视网膜的表达 , 可能起到治疗视网膜脱离术后视网膜下液吸收缓慢的作用。
关键词： 视网膜脱离,环氧合酶 -2.丹皮酚,丹皮酚磺酸钠
孔源性视网膜脱离(rhegmatogenous retinal detachment，RRD ) 可采用巩膜扣带术进行治疗， 但研究发现， 巩膜扣带术后 6 月 有 50%~78% 患者仍然存在发现视网膜下液(SRF) [1-3] 。SRF 损害感光细胞功能 , 影响患者的最佳矫正视力或延缓患者的视 力恢复， 是术后视物变形、视物发暗、延缓视力恢复的重要原 因。目前， 针对 SRF 的治疗主要包括普通手术激光、光动力激 光、糖皮质激素等 [4-5] 。有研究报道 [6] 环氧合酶 -2 ( COX-2 ) 抑制剂可减少残余 SRF 的发生率，并增强机体的抗炎活性。 本研究观察丹皮酚磺酸钠对兔子视网膜脱离模型中 COX-2 的 表达影响情况，以确定其是否能在 SRF 吸收中起到作用。
1 材料与方法
1.1 材料与动物 研究地点：贵州医科大学，日本大耳 兔 9 只， 体重(2.2±0.13)kg， 雌雄不限， 饲养条件： 温 度 18 ℃~26 ℃，湿度： 30%~70%。经贵州医科大学附属 医院医学伦理委员会批准。
1.2 实验试剂与仪器 透明质酸酶( CAS： 37326-33-3. 索来宝)、丹皮酚磺酸钠(郑州阿尔法化工有限公司， A2012117.10 g)、利多卡因(湖北天药药业股份有限公 司，国药准字：H20133209.规格： 5 mL/ 支)、全自动酶 标仪(北京六一生物科技有限公司，型号：WD-210)、冷 藏冷冻箱(美的， 型号 BD/BC-415DKEM )、电热恒温培 养箱(山东博科生物产业有限公司，型号 DHP-9054 )。
1.3 实验方法及动物处理 9 只日本大耳兔，空白对照组
3 只，不做任何处理;动物造模采用孙声桃等 [7] 改造的兔 视网膜脱离模型方法，模型对照组 3 只，一只眼睛造模一只正常;模型治疗组 3 只，双眼造模，造模后每天予丹 皮酚磺酸钠 5 mg/kg，肌内注射 1 次 /d，连续 3 d。治疗： 造模后一天一次肌内注射 5 mg/kg 丹皮酚磺酸钠治疗 3 d; 取样：造模后 1、3、7 d，每组取 1 只(空白对照组随机选 1 眼、模型对照组和模型治疗组取造模眼)取玻璃体液和 视网膜做酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。处死方式： 注射水合氯醛过量麻醉或采血处死。
1.4 主要试剂 配制丹皮酚磺酸钠 5mg/kg;称取 500 mg 丹皮酚磺酸钠溶解到 50 mL 生理盐水中得到 5 mg/0.5 mL 液体，肌内注射 1 次 /d，连续 3 天。
1.5 COX-2 检测方法 取眼球视网膜组织及玻璃体液， 通过 ELISA 试剂盒检测其中 COX-2 的水平。
1.6 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据处 理分析，实验数值结果以(x ±s)表示，组间及多组间多个 样本均数间的多重比较比较用 LSD-t 检验方法，P<0.05 表 示差异有统计学意义。
2 结果
三组日本大耳兔视网膜样本及玻璃体液 COX-2 水平 见表 1; 丹皮酚磺酸钠治疗组与空白对照组、视网膜脱离模 型组视网膜样本 COX-2 水平在第 3 天及第 7 天下降明显， 差异有统计学意义(P<0.05 ); 玻璃体液 COX-2 水平在各 组间差异均无统计学意义。
3 讨论
视网膜脱离属中医“暴盲”范畴， 而牡丹皮清热凉血， 活血化瘀，可以于暴盲。研究表明，丹皮酚有强大的抗炎活性 [8- 15] 。黄利挂 [16] 基于 COX-2 的蛋白受体结构和丹皮 酚的抗炎活性，以丹皮酚为先导物设计合成出丹皮酚衍生 物 7a-7h 进行实验研究， 证明其可抑制 COX-2 的活性， 提 高炎症抑制率。研究显示 [17- 18] ，丹皮酚的抗炎活性是通过 抑制或阻断促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的细胞外调 节蛋白激酶(ERK)及 p38 信号通路来抑制肿瘤坏死因子 ( TNF ) -α 黏附分子的表达来实现。
吲哚菁绿血管造影检查发现 [1.19] ，在 SRF 延迟吸收的 患眼中， 脉络膜的渗出增多是 SRF 延迟吸收的重要原因。 巩膜外加压会导致视网膜的局部缺血和炎症反应，在炎症 反应过程中，单核 / 巨噬细胞分泌 TNF-α， TNF 刺激免疫 细胞产生更多的炎症因子和介质。炎症介质中花生四烯酸 ( AA)主要通过环氧合酶代谢，在 AA 转化中， COX 是 关键的诱导酶，其中 COX-2 可在 TNF 等刺激下高度表达 催化合成与病理过程有关的前列腺素(PG)类物质。研究 发现 COX-2 在炎症部位的蛋白表达量增加，是由 TNF-a 通过激活细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、 p38 丝裂原活 化蛋白激酶(p38 MAPK)和核因子 κB ( NF-κB)信号转 导途径诱导 COX-2 mRNA 的蛋白表达而产生的 [20-22] ，同 时炎症介质中的缓激肽也可以通过激活 ERK1/2 和 NF-κB 信号通路影响 COX-2 和 PGE2 在体内的表达和释放而促 进炎症的发展。故有通过干扰 COX-2 酶的合成减轻局部 炎症反应， 从而减少脉络膜的渗出， 达到促进 SRF 吸收的 可能。
在既往的研究中发现人类角膜上皮、正常结膜杯状细 胞、正常的角膜内皮和正常的眼内血管内皮存在 COX-2. 本实验中观察丹皮酚磺酸钠对视网膜组织中的 COX- 表达 2 影响， 实验结果与其他研究 [23] 类似。遗憾的是在实验中 玻璃体液 COX-2 水平全程无差异， 考虑为模型中玻璃体对 视网膜中 COX-2 的扩散有限制作用， 或者是由于与模型及 动物的自愈性有关。本实验中造模眼的 COX-2 表达更强， 且丹皮酚治疗组第 3 天较另外两组明显降低，证实丹皮酚 衍生物丹皮酚磺酸钠可能是在兔视网膜脱离模型中通过抑 制或阻断 MAPK 的 ERK 和 p38 信号通路来抑制 TNF-α 和 黏附分子的表达， 从而抑制 COX-2mRNA 的蛋白表达。表 明丹皮酚磺酸钠可能影响 PGE2 的合成，改善巩膜外加压会导致视网膜的炎症反应和缺血性改变，并有可加快 SRF 吸收，促进视力恢复加快及改善预后可能。
综上所述，丹皮酚磺酸钠可通过 ERK1/2、p38 和NF-κB 信号转导途径下调兔视网膜脱离模型中视网膜 COX-2 的 表达，有加快 SRF 吸收，促进视力恢复加快及改善预后 可能。本实验的不足之处在于一是实验组动物数量太少， 二是 COX-2 存在物种区别，如 COX-2 活性在正常犬的葡 萄膜，正常兔角膜上皮、间质和内皮，正常人全身血管和 人结膜杯状细胞均有分布，本实验的阳性结果也有可能是 ELISA 检测技术的较高敏感性。这些均需要进一步研究， 期待更进一步的研究能解决这些问题。
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