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脾虚型功能性腹泻大鼠模型的建立论文

发布时间:2020-10-17 13:39:19 文章来源:SCI论文网 我要评论














SCI论文(www.scipaper.net):

摘要:目的探讨大黄灌胃建立脾虚型功能性腹泻大鼠模型的可行性。方法将28只大鼠采用随机数表法分为4组:大黄高、中、低浓度组和对照组。大黄分别按生药量15g/(kg•d)、7.5g/(kg•d)、3.75g/(kg•d)给高、中、低浓度组大鼠灌胃,对照组给予等剂量纯水。观察记录大鼠一般状态,体重变化,稀便率、稀便级和腹泻指数,分析旷场实验(Open Field Test,OFT)数据,并比较各组大鼠血清D-木糖浓度,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清白介素17(InterIeukin-17,IL-17)水平。结果大黄生药量15g/(kg•d)灌胃大鼠可致大鼠脾虚泄泻,体重减轻,活动度下降,小肠吸收率下降,免疫功能失调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大黄灌胃建立脾虚型功能性腹泻大鼠模型具有可行性,以生药浓度15g/(kg•d)效果最佳。

关键词:脾虚型功能性腹泻;旷场实验;酶联免疫吸附实验

本文引用格式:肖怡,邓向亮,傅南琳,等.脾虚型功能性腹泻大鼠模型的建立[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(96):219-221.

Establishment of Rat Model of Spleen-deficiency Functional Diarrhea

XIAO Yi,DENG Xiang-liang,FU Nan-lin,CHEN Jia

(Department of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong)

ABSTRACT:Objective To explore the feasibility of establishing a rat model of functional diarrhea with spleen deficiency by rhubarb administration.Methods Twenty-eight rats were divided into 4 groups by random number table method:high,medium,low concentration groups of rhubarb and control group.Rhubarb was administered to rats in the high,middle and low concentration groups according to the crude drug dosage of 15g/(kg•d),7.5g/(kg•d)and 3.75g/(kg•d).The control group was given equal dose of pure water.The general state and body weight of each group of rats were recorded,and the stool rate,loose stool level and diarrhea index were calculated.The Open Field Test(Open Field Test,OFT)experimental data were analyzed,and the serum D-xylose concentration of each group was compared.Serum interleukin-17(IL-17)levels were detected by ELISA.Results Rats with rhubarb had a dose of 15g/(kg•d),which could cause spleen diarrhea,weight loss,decreased mobility,decreased intestinal absorption rate,and immune dysfunction.The difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion It is feasible to establish a rat model of functional diarrhea with spleen deficiency by rhubarb administration.The concentration of crude drug is 15g/(kg•d).

KEY WORDS:Spleen-deficiency functional diarrhea;Open Field Test;ELISA

0引言

功能性腹泻是临床上消化系统常见的一种病因不明的疾病,其腹泻表现与中医脾虚泄泻症状相似,功能性腹泻患者亦常诊断为脾虚证,属于中医“泄泻”的范畴,主要病位在“脾”。功能性腹泻作为疾病的实验研究较少,成熟的功能性腹泻动物模型制作方法及评价方法都欠缺[1],因此我们在造功能性腹泻模型时参考脾虚证腹泻的病因进行模型制作及评价研究具有非常重要的意义。

《景岳全书·泄泻》:“泄泻之本,无不由于脾胃”。李杲:“大忌苦寒之药损其脾胃”。大黄,又名将军,火参,性味苦寒,归脾、胃、大肠经,攻积滞、清湿热,为苦寒泻下法建立脾虚型模型最为常用的中药之一[2],本文就不同浓度的大黄颗粒水溶液灌胃建立功能性腹泻模型效果与适宜剂量进行了观察评价。

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1材料和方法

1.1动物


SD大鼠,雄性,28只,体质量300±20 g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。动物许可证编号为SCXK(鲁)20140007。

1.2药品与试剂

大黄(中药颗粒)购于广东药科大学附属第一医院,由广东一方制药有限公司提供。D-木糖测定试剂盒(比色法)购买自南京建成生物工程研究所。大鼠白介素17(IL-17)ELISA试剂盒购买自酶免公司产品。

1.3仪器

Epoch酶标仪(Biotek)、GHX-9050B-1型隔水式恒温培养箱(上海福玛实验设备公司)、ATX224电子天平(SHIMADZU)、MX-F涡旋混匀器(Servicebio)。行为学自动观察分析系统由暨南大学行为学实验室提供研究设备,含计算机、摄像监控以及observior、ethevision分析软件。

1.4动物分组及模型制备

按照随机分组原则,将28只大鼠采用随机数表法分为大黄高浓度组(7只)、大黄中浓度组(7只)、大黄低浓度组(7只)和对照组(7只)。

SD大鼠适应性饲养1周后,根据卫生部颁布的《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》和《实用中医证候动物模型学》,采用苦寒泻下方式复制脾虚泄泻证模型[3,4],禁食4-6 h,大黄颗粒水溶液高浓度组每只大鼠每日灌胃15g/(kg•d)(生药量)2mL,中浓度组每只大鼠每日灌胃7.5g/(kg•d)2mL,低浓度每只大鼠每日灌胃1.56g/(kg•d)2mL,对照组每只大鼠每日灌胃2mL纯水,均连续给药7d。

1.5检测指标与方法

1.5.1一般形态学观察


每天对大鼠腹泻情况、粪便质地、体重、精神活动状态、皮毛色泽、摄食量、行为活跃程度等进行观察记录。观察每只大鼠的稀便数、总便数、稀便污染滤纸所形成的污迹面积,计算腹泻指数[5]。

腹泻指数:腹泻指数=稀便率×稀便级,稀便率=每只动物的稀便次数/大便总次数(稀便以滤纸上有无污迹为准),稀便级根据滤纸上污迹范围大小分为四级:一级的污迹直径≤1cm;二级的污迹直径≤1~3cm;三级的污迹直径≤3~5cm,四级的污迹直径≥5cm。

1.5.2旷场实验(OFT)

采用立方形黑底塑料旷场箱,其底面为黑色正方形,摄像头置于中央格正上方。实验时将SD大鼠放箱内底面中心,实验人员远离旷场箱,同时进行摄像5min[6]。每只SD大鼠实验结束后清理箱内粪便污迹,并喷洒酒精擦拭箱底及侧壁,以免污迹气味影响下次测试,最后用计算机软件对录像进行数据分析。第7天进行OFT测量运动平均速度,观察其活动度。

1.5.3小肠吸收率的测定

小肠吸收率:利用间苯三酚法对大鼠血清D-木糖含量进行测定。在强酸溶液中,D-木糖脱水产生糠醛,后者与间苯三酚反应成粉红色化合物,在554nm处比色测定,通过计算可求出D-木糖含量。

1.5.4ELISA检测IL-17的表达量

造模结束后,收集大鼠腹主动脉血,匀浆离心后吸取上清液按照ELISA试剂盒说明书进行IL-17含量的ELISA检测,根据数据制作标准曲线及方程,换算得出各样本细胞因子的含量。

2统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理,数据采用均数±标准差表示,组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05为差异具有统计学意义。

3结果

3.1一般形态学观察


高浓度大黄颗粒水溶液灌胃组大鼠出现腹泻便溏、肛门污秽、纳少、消瘦、体重减轻、拱背、精神倦怠、眯眼、蜷缩、扎堆、畏寒、少动、反应迟缓、四肢无力、毛发疏松枯槁欠光泽等症状;中等浓度大黄灌胃大鼠也出现腹泻便溏,肛门污秽,纳少,体重减轻,毛发枯槁等症状,但整体症状有所减轻,精神可,活动度可。而低浓度组大鼠腹泻情况较高浓度组轻,精神活动度较对照组相差不大。而对照组大鼠大便正常,进食积极,精神状态良好。

3.2体重

实验结果显示,正常对照组大鼠体重增加平稳,大黄造模组的大鼠体重呈现不同程度的减轻,体重下降程度与大黄给药浓度呈正相关。如图1。




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3.3进食量

实验结果显示,大黄造模组大鼠进食量较正常对照组减少,大黄给药浓度越高,食量越小。如图2。


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3.4各组大鼠稀便率、稀便级与腹泻指数比较

实验结果显示,高浓度大黄颗粒水溶液灌胃组大鼠腹泻指数明显高于中、低剂量组大鼠(P<0.05),腹泻效果明显。而正常对照组无腹泻,腹泻指数为0。如图3,图4,图5。


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3.5旷场实验(Open Field Test,OFT)

OFT实验结果显示,高浓度大黄给药组大鼠运动平均速度明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。低剂量组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。如图6,表1。


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3.6血清D-木糖含量测试

实验结果显示:与对照组相比,不同浓度的大黄颗粒水溶液灌胃组血清D-木糖含量显著降低(P<0.05),说明脾虚泄泻时小肠吸收功能低下,而高剂量大黄给药组造成大鼠小肠吸收率降低效果最为显著。如图7,表2。


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3.7Elisa法测定不同组别大鼠IL-17

研究发现,高浓度大黄造模组与对照组比较大鼠血清中Th17细胞因子IL-17显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而低剂量给药组与对照组比较血清中IL-17的含量差异无统计学意义(P>0.05)。




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4讨论

脾虚型功能性腹泻因其病因尚不明确[7],功能性腹泻作为疾病的实验研究较少,成熟的脾虚型功能性腹泻动物模型制作方法及评价方法都欠缺[1],因此我们在造脾虚型功能性腹泻模型时参考脾虚证腹泻的病因进行模型制作及评价研究非常重要与有意义。大黄,性味苦寒,归脾、胃、大肠经,为苦寒泻下法建立脾虚型模型最为常用的方法之一,但不少学者用这种方法建立的功能性腹泻模型的效果尚存在争议[2]。有研究显示[8],大黄的泻下作用较缓且鞣制含量较多,在腹泻后可出现便秘症状。笔者研究过程中,尚未见便秘症状,高剂量大黄泻下作用显著。由于大黄还含有抗细菌、抗病毒、增强免疫力等有效成分,因此低剂量的大黄组大鼠效果不是很明显。由于造脾虚型FD模型,脾主运化,胃主受纳,脾胃虚弱,不能受纳水谷和运化精微,故大鼠纳食减少,又伤津耗气,故体重减轻。由于大鼠正处于生长期,故对照组体重增加。本研究中,不同浓度的大黄颗粒水溶液灌胃的大鼠均出现不同程度腹泻,高浓度组大鼠稀便率、稀便级与腹泻指数明显高于中低剂量组,腹泻效果明显。OFT实验是评价啮齿类动物在新的环境中自发活动和探索行为的一种经典方法,被应用于分析动物的焦虑度、紧张度、兴趣度等行为学的评估,在一定程度上体现了实验动物中枢神经系统的兴奋度,又因为OFT实验可以直观反应单位时间内实验动物的运动距离,运动平均速度等指标,亦被运用于实验动物运动功能的替代评估。[9-12]OFT实验结果显示高浓度大黄造模组较对照组大鼠运动速度最慢,精神以及活动度下降最明显。D-木糖为戊糖,内服后在小肠的吸收为易化扩散。有研究表明脾虚泄泻患者及实验性脾虚动物由于吸收功能降低而致血清D-木糖含量降低[13],故血清D-木糖含量是检测脾虚泄泻的重要客观指标。脾虚泄泻时小肠吸收功能低下,对D-木糖吸收代谢有一定影响,高浓度大黄造模组血清D-木糖含量显著降低,提示小肠吸收功能减弱明显。有研究表明[14],脾虚模型大鼠的免疫功能失调,Th17细胞是机体的免疫细胞,参与适应性免疫,Th17细胞主要分泌细胞因子IL-17。Elisa实验表明高浓度大黄促进IL-17的大量分泌,效果显著。

综上所述,大黄灌胃建立脾虚型功能性腹泻大鼠模型具有可行性,以生药浓度15g/(kg•d)效果最佳。

参考文献

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[14]邵铁娟,李海昌,谢志军,等.基于脾主运化理论探讨脾虚湿困与肠道菌群紊乱的关系[J].中华中医药杂志,2014,29(12):3762-3765.

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